Giardia duodenum giardiasia eragiten duen organismo parasito bat da, hesteetako infekzioa bereziki ohikoa den ume txikietan beherakoaren seinale klinikoak dituztenak.Aurretik jakinarazi dugu zelulaz kanpoko G. duodenalis-ek zelula barneko oligomerizazioaren antzeko 3. (NLRP3) lotzen dituen nukleotidoen aktibazioa aktibatzen duela eta ostalariaren hanturazko erantzunak erregulatzen dituela zelulaz kanpoko besikulen (EV) jariaketaren bidez.Hala ere, prozesu honetan parte hartzen duten patogenoekin lotutako EV duodenokokoaren (GEV) eredu molekular zehatzak eta NLRP3 inflamasomak giardiasian duen papera argitu gabe daude.
GEV-en pcDNA3.1(+)-alfa-2 eta alfa-7.3 giardinak adiera eukariotiko birkonbinatzaileak eraiki ziren, saguaren makrofago peritoneal primarioetan transfektatu eta hantura-helburuko caspasa-1 molekula neurtuz detektatu ziren.p20 adierazpen maila aztertu zen..G. duodenalis alfa-2 eta alfa-7.3 giardinak jatorriz identifikatu ziren NLRP3 inflamasoma (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 eta caspase-1 p20), IL jariapena neurtuz.1β mailak, apoptotic spotted protein (ASC) oligomerizazio mailak eta NLRP3 eta ASCren lokalizazio immunofluoreszentea.Ondoren, NLRP3 inflamasomak G. duodenalis-en patogenikotasunean duen eginkizuna ebaluatu zen, zeinetan NLRP3 aktibazioa blokeatuta zegoen saguak erabiliz (NLRP3 blokeatutako saguak) eta gorputz-pisuaren, duodenalaren karga parasitoaren eta duodenoaren ehunaren aldaketa patologikoak kontrolatu ziren.Horrez gain, hiardinak alfa-2 eta alfa-7.3-k IL-1β jariapena eragiten duten in vivo NLRP3 inflamasomaren bidez ikertu genuen eta molekula hauek G. duodenalis-en patogenikotasunean duten zeregina zehaztu genuen.
Alfa-2 eta alfa-7.3 giardinek NLRP3 inflamasomaren aktibazioa eragiten dute in vitro.Honek p20 caspase-1 aktibatzea ekarri zuen, NLRP3, pro-IL-1β eta pro-caspase-1 proteinen espresio-mailak handitzea, IL-1β jariapena nabarmen handitzea, ASA orbanak sortzea. zitoplasma eta ASA oligomerizazioaren indukzioa.NLRP3 hantura Penile galerak G. duodenalis-en patogenikotasuna areagotzen du saguetan.NLRP3 blokeatuta dauden saguen gavage bidez kisteekin tratatutako saguek trofozoito-kopurua handitu zuten eta duodeno-billoetan kalte larria erakutsi zuten, uzkurtuta eta adarkatuta zeuden kripta nekrotikoekin.In vivo esperimentuek erakutsi dute giardinak alfa-2 eta alfa-7.3 NLRP3 inflamasomaren bidez IL-1β jariatzea eragin dezaketela, eta giardinak alfa-2 eta alfa-7.3-ekin immunizazioak G. duodenalis-en patogenikotasuna murriztu zuen saguetan.
Batera hartuta, ikerketa honen emaitzek iradokitzen dute giardia alfa-2 eta alfa-7.3 ostalariaren NLRP3 hanturaren goranzko erregulazioa eragiten dutela eta saguetan G. duodenalis-en infektibitatea murrizten dutela, giardiasia prebenitzeko helburu itxaropentsuak baitira.
Giardia duodenum heste meharrean bizi den zelulaz kanpoko protozoo parasitoa da eta urtero beherakoa duten giardiasi 280 milioi kasu eragiten ditu, batez ere garapen bidean dauden herrialdeetako haur txikien artean [1].Pertsonak kutsatzen dira edateko ura edo elikagaiak M. duodenum kisteak kutsatuta, gero urdailean sartzen dira eta zuku gastrikoetan kanporatzen dira.Giardia duodenum trofozoitoak duodenoko epitelioari atxikitzen zaizkio, goragalea, oka, beherakoa, sabeleko mina eta pisua galtzea eraginez.Inmunoeskasiaren eta fibrosi kistikoa duten pertsonak infekzioa jasan dezakete.Infekzioa ahozko eta analeko sexuaren bidez ere gerta daiteke [2].Metronidazol, tinidazol eta nitazoxanide bezalako sendagaiak dira duodenoko infekzioen tratamendurako aukerarik hobetsiak [3].Hala ere, kimioterapia-farmako hauek bigarren mailako efektu kaltegarriak eragiten dituzte, hala nola goragalea, kartzinogenia eta genotoxikotasuna [4].Horregatik, estrategia eraginkorragoak garatu behar dira G. duodenalis infekzioa saihesteko.
Inflammasomak berezko erantzun immunearen parte diren proteina zitosoliko konplexuen klase bat dira, patogenoen inbasioaren aurka defendatzen eta hanturazko erantzunak bideratzen laguntzen dutenak [5].Inflamsoma horien artean, nukleotidoen lotura-oligomerizazioa (NOD) 3. errezeptorea (NLRP3) nukleotido-lotura-oligomerizazioa (NLRP3) nukleotidoen lotura-itxurako inflamasoma asko ikertu da, patogeno/kalteekin lotutako hainbat eredu molekularren bidez detekta baitezakete (PAMP/). DAMP), berezko sistema immunologikoa aktibatzen du.eta hesteetako homeostasia erregulatzen du hanturazko gaixotasun askotan [6,7,8].Patroi-ezagutze-hartzaileak (PRR) NLRP3, proteina apoptotiko egokitzaile batek (ASC) eta procaspase-1 edo procaspase-11 efektore batek osatzen dute.NLRP3 inflamasomak ostalari gisa jokatzen du patogenoen inbasioaren aurka, Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] eta Leishmania ikerketetan ikusitako moduan.[11], baina NLRP3 inflamasomaren aktibazioak erantzun immune babesgarriak mugatzen dituela eta gaixotasunaren progresioa areagotzen duela ere jakinarazi da, adibidez, zizareetan [12].Gure aurreko aurkikuntzetan oinarrituta, zelulaz kanpoko G. duodenalis-ek NLRP3 hanturaren zelula barneko aktibazioa aktibatzen duela eta ostalariaren hantura-erantzunak modulatzen dituela jakinarazi genuen zelulaz kanpoko besikulak (EVs) jariatuz [13].Hala ere, G. duodenalis in vivo infekzioan NLRP3 inflamasomaren papera zehaztu gabe dago.
Giardins jatorriz G. duodenalis zitoeskeletoaren osagai estruktural gisa deskribatu zen eta trofozoitoen mugikortasunean eta heste meharrean epitelio-zelulen eranskinean paper garrantzitsua betetzen dute.Ingurunera hobeto egokitzeko eta haien patogenikotasuna areagotzeko, G. duodenalis trofozoitoek 8 flagelo, erdiko gorputz 1 eta disko bentral 1ez osatutako zitoeskeleto-egitura berezia garatu zuten [14].Giardia duodenoko trofozoitoek beren zitoeskeletoa erabiltzen dute goiko heste meharrean barneratzeko, batez ere duodenoan, eta enterozitoei atxikitzeko.Etengabe migratzen dira eta zelula epitelialetara lotzen dira zelulen metabolismoa erabiliz.Hori dela eta, harreman estua dago haien zitoeskeletoaren eta birulentziaren artean.Giardia duodenorako berariazko Giardines zitoeskeletoaren egituraren osagaiak dira [15] eta lau klasetan banatzen dira: α-, β-, γ- eta δ-giardinak.α-giardin familiako 21 kide daude, eta guztiek dute fosfolipidoak lotzeko kaltzioaren menpeko gaitasuna [16].Gainera, zitoeskeletoa zelularen mintzarekin lotzen dute.G. duodenalis-ek eragindako beherakoa duten pertsonetan, α-giardinak oso adierazita eta immunoreaktiboak dira infekzioan [17].Giardia alfa-1-n oinarritutako txerto heterologoek giardiasiaren aurka babesten dute saguetan eta txertoa garatzeko antigeno hautagai potentzialak dira [18].Alfa-8 giardinak, mintz plasmatikoan eta flageloetan kokatuta, baina ez disko bentralean, trofozoitoen mugikortasuna eta hazkunde-tasa hobetzen ditu G. duodenalis-en [19].Alfa-14 giardina flageloetako mikrotubuluen egituretara atxikitzen da eta G. duodenalis-en bideragarritasunari eragiten dio [20].Alfa-11 giardina ugari dago bizi-ziklo osoan, eta alfa-11 giardinaren gehiegizko adierazpenak G. duodenalis berari kalte egiten dio [21].Hala ere, ez dago argi alfa-2 giardina eta alfa-7.3 giardina G. duodenalis infekzioaren eta haien azpiko mekanismoen aurkako babesa ote duten.
Azterketa honetan, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine eta pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine espresio eukariotiko birkonbinatzaileak saguaren makrofago peritoneal primarioetan transfektatu ziren NLRP3 ostalariaren aktibatzeko.Ondoren, Inflammasome helburuak aztertu ziren.NLRP3 inflamasomak G. duodenalis-en patogenikotasunean duen eginkizuna ere ebaluatu dugu, alfa-2 eta alfa-7,3 giardinak NLRP3 inflamasomaren aktibazioa in vivo eragiten duten ala ez ikertu dugu, eta giardinak bi rol hauek patogenikotasunean duten ala ez. G. duodenalis.Gure helburu komuna G. duodenalis infekzioa prebenitzeko helburu itxaropentsuak garatzea zen.
Basati motako (WT) C57BL/6 5-8 asteko sagu emeak Liaoning Changsheng Experimental Animal Centerretik (Liaoning, Txina) erosi ziren.Saguek ura askea zuten, janari esterilizatua jasotzen zuten eta 12/12 orduko argi/ilun zikloan mantentzen ziren.Infekzioa baino lehen, saguek ad libitum antibiotikoak jaso zituzten anpizilina (1 mg/mL), vancomycin (1 mg/mL) eta neomizina (1,4 mg/mL) (denak Shanghai, Txina, organismo artifizialekin erositakoak) osatutako uretan [22]. ].].> 24 orduz jateko eta edateko gaitasuna galdu zuten eta gorputzaren pisua ≥ 20% galdu zuten saguak gizatasunez eutanasia izan ziren zerbikalaren dislokazioaren bidez.
WB G. duodenalis trofozoitoak (American Type Culture Collection, Manassas, AEB) behi fetalaren serumaren % 12,5 (FBS; Every Green, Zhejiang, Txina) eta behazunaren % 0,1 (Sigma-Aldrich, St. Missouri, AEB) gehitu ziren. ).AEB) baldintza mikroaerobikoetan.Trofozoito konfluenteak izotzetan bildu eta 1:4ko proportzioan igarotzen ziren ugalketa gehiago egiteko.
Giardia duodenum kisteak aurretik deskribatu bezala [23] induzitu ziren, trofozoitoak fase logaritmikoan bildu eta gero enkapsulazio induzitzailearekin diluitu ziren, pH 7,1 (TYI-S-33 aldatua) 1 × 106 trofozoito/mL-ko azken kontzentraziora.behazun-kontzentrazioa % 0,05 ertaina).Trofozoitoak baldintza anaerobikoetan hazi ziren 37 °C-tan, hazkuntza logaritmikoko fasera arte.Aldatu medioa kisteak induzitzen dituen medio batera (pH 7,8; ​​aldatutako TYI-S-33 medioa % 1eko behazun-kontzentrazioarekin) eta hazi G. duodenalis 37 °C-tan 48-96 orduz, eta horietan eraketa-kistoak mikroskopioan behatu ziren.Trofozoito gehienak kisteak eratzera bultzatu ondoren, kultura-nahasketa bildu eta ur deionizatu antzuan berriro eseki zen, gainerako trofozoitoak lizatzeko.Kisteak zenbatu eta 4 °C-tan gorde ziren saguetan hodi gastriko baten bidez gero aztertzeko.
Giardia zelulaz kanpoko besikulak (GEV) aberastu ziren aurretik deskribatu bezala [13].Hazkunde logaritmikoko fasean dauden trofozoitoak exosomak agortutako FBSrekin (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) 1 × 106 parasito/ml-ko azken kontzentraziora suspentsi zituzten eta 12 orduz inkubatu ziren TYI-S-33 medio eraldatuan.2000 g-tan 10 min, 10.000 g 45 min eta 100.000 g 60 min.Prezipitatuak fosfato tamponatuaren gatz salinoan (PBS) disolbatu ziren, BCA proteina saiatze-kit baten bidez kuantifikatu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AEB) eta -80 °C-tan gorde ziren edo zuzenean analisi gehiago egiteko erabili ziren.
Saguaren makrofago peritoneal primarioak aurretik deskribatu bezala prestatu ziren [24].Laburbilduz, saguei (6-8 aste bitartekoak) injektatu zitzaien (intraperitoneal [ip]) 2,5 ml 2,98% Difco tioglikol medio likidoarekin (BD, Franklin Lakes, NJ, AEB) eta 3-4 ahosabai elikatu zituzten.Makrofagoen esekidura bat saguen barrunbe abdominaletik bildu zen eutanasia ondoren eta 3 aldiz zentrifugatu zen 1000 g-tan 10 minutuz.Bildutako zelulak fluxu-zitometriaren bidez detektatu ziren CD11b markatzailea erabiliz zelulen garbitasuna % 98 izan arte, gero 6 putzuko zelula-hazkuntzako plaketara gehitu (4,5 x 106 zelula/putzu) eta % 10eko FBS (Bioindustria) 37 °C-tan inkubatu ziren.eta %5 CO2.
RNA 1 × 107 trofozoitoetatik atera zen TRIzol erreaktibo 1 mltan (Vazyme, Nanjing, Txina), DNA genomikoa G. duodenalis RNA osotik atera zen MonScript dsDNase erabiliz (Monad, Wuhan, Txina) eta DNA osagarria (cDNA) sintetizatu zen. MonScript RTIIII Super Mix (Monad) erabiliz, fabrikatzailearen argibideen arabera.
Helburuko G. duodenalis genearen CDS sekuentziaren informazioa NCBI GenBanketik lortu da.Erabili Primer 5.0 xede-gene bakoitzerako klonazio-hastapen zehatzak diseinatzeko.Aurrerako abiarazleak (5′-3′) hiru zati ditu: gainjarritako sekuentzia bat pcDNA3.1(+) EcoRV bektore linealizatu batekin (TGGTGGAATTCTGCAGAT) eta hasierako kodoiak ATG eta GNN (lehen oinarria G ez bada).Hau adierazpenaren eraginkortasuna hobetzeko egiten da.Horrez gain, gutxienez 16 bp base konbinatuak (GC edukia % 40-60/Tm 55 °C inguru).Alderantzizko abiarazleak (5′-3′) bi zati ditu, EcoRV linealizatutako pcDNA3.1(+) bektore batekin (GCCGCCACTGTGCTGGAT) eta gutxienez 16 bp-ko oinarri konbinatu batekin gainjarritako sekuentzia bat.(azken bi geltokiak kenduta).oinarriak) AA edo GA bezalako kodoi bat plasmido birkonbinatzaileei etiketatutako proteinak adierazteko).Primer sekuentziak 1. taulan ageri dira eta Kangmet Biotechnology Co., Ltd.-ek (Changchun, Txina) sintetizatu zituen.
Helburuak Pfu DNA polimerasa (Tiangen, Beijing, Txina) edo Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, Txina) erabiliz anplifikatu ziren, prestatutako G. duodenalis cDNA txantiloi gisa erabiliz.PCDNA3.1(+) adierazpen bektore eukariotoaren plasmidoa EcoRV murrizketa entzimarekin linealizatu zen eta Fast AP (Thermo Fisher Scientific) erabiliz desfosforilatu zen.PCDNA3.1(+) linealizatutako zatiak eta helburu genearen zati anplifikatuak DNA gel arazteko kit baten bidez (Tiangen) araztu eta Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) erabiliz kuantifikatu ziren.pcDNA3.1(+) zatia eta helburu-genearen zati bakoitza birkonbinatu ziren MonClone bakarreko klonatze nahasketa erabiliz (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) eta DNA sekuentziazioaren bidez baieztatu ziren Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Txina) erabiliz..
Endotoxinarik gabeko pcDNA3.1(+)-alpha-2 eta pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 plasmidoak SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) erabiliz sortu ziren.Kontzentrazioa 500 ng/µl-tik gora mantendu zen eluzio-buffer-eko EDTAk transfekzio-saiakuntzan oztopatzen ez zuela ziurtatzeko.Saguaren makrofago peritoneal primarioak 6 putzuko plaketan hazi ziren RPMI 1640 medio osoarekin (Biological Industries) 12 orduz, ondoren zelulak 3 aldiz garbitu ziren PBS epeletan penizilina eta estreptomizina kentzeko, eta, ondoren, medio osoz osatutako medioan.Endotoxinarik gabeko pcDNA3.1(+)-alfa-2 eta pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) plasmidoak Opti-MEM murriztuko suero-medio 125 μl-tan diluitu ziren (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Ondoren, 5 µl Lipofectamine 2000 transfekzio erreaktibo (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) 125 µl serum baxuko Opti-MEM medioan diluitu ziren.Prestatu liposoma-DNA konplexuak diluitutako endotoxinarik gabeko plasmidoa Lipofectamine 2000-ekin nahastuz eta nahasketa giro-tenperaturan egon dadin utziz 5 minutuz.Transferitu konplexuak bereizita putzu bakoitzeko zeluletara eta nahastu poliki-poliki.4 ordu igaro ondoren, zelula-hazkuntza-eremua RPMI 1640 medio osoko 2 mlrekin ordezkatu zen eta 24 orduz jarraitu zen.Zelula-hazkuntza-euskarri freskoa zelulei gehitu eta denbora-puntu ezberdinetan inkubatu egin zen saiakuntzaren diseinuaren arabera.
Gainontzeko eta zelula-lisatuetako proteina-laginak aurretik deskribatu bezala prestatu ziren [25].Pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actina eta His-tag-en mintz-transferentzia-parametroak 200 mA/90 min izan ziren.Interleukin 1β (IL-1β; I+D Systems, Minneapolis, Minnesota, AEB), caspase-1 (p20) (Adipogen, Suitza) eta NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Suitza) eta 1:5000 His tag (Amylet Scientific, Wuhan, Txina) eta β-aktina (Proteintech, Wuhan, Txina).
Disuccinimide suberatoarekin (DSS) gurutzatua egin zen aurretik deskribatu bezala [26].Zelulak 3 aldiz garbitu ziren PBS hotzarekin eta guztiz lisatu ziren 27 gauge orratz batekin 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES eta 125 mM NaHCO3 zituen 50 µl ASC erreakzio buffer batean (pH 8,0).Nahasketa 5000 g-tan zentrifugatu zen 3 minutuz eta pelleta 10 µl DSS (25 mM DMSOn) eta 40 µl ASC erreakzio bufferrekin josi zen 30 minutuz 37 °C-tan.10 minutuz 5000 g-tan zentrifugatu ondoren, pelleta ASC erreakzio bufferren 40 µl eta 6x proteina kargatzeko tamponaren 10 µl disoluzio batean disolbatu zen (TransGen, Beijing, Txina), eta, ondoren, disoluzioa giro-tenperaturan itzali zen 15 urtez. min., Gero irakiten 10 minutuz.Ondoren, proteina-laginak Western blotting egin ziren, ASCren aurkako antigorputz primarioak erabiliz (Wanleibio, Shenyang, Txina), 1:500 diluzio-ratioan.
Aurretik deskribatutako prozedura bati jarraituz [13], zelula-hazkuntzako gainnatzaileak bildu ziren eta IL-1β zitokina proinflamatorioaren jariapena zehaztu zen IL-1 Beta ELISA kitaren bidez (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Bihurtu OD450nm balioak proteina-kontzentrazioetara IL-1β kurba estandarra erabiliz.
Estalkietan estalitako zelulak astiro-astiro garbitu ziren 3 aldiz PBS epelean, ehun-zelulen finkatzaile batean finkatuta (Biosharp, Beijing, Txina) 10 minutuz giro-tenperaturan (RT), %0,1 Triton X-Permeabilize 100tan (PBS-n diluitua; Biosharp). ) 20 minutuz giro-tenperaturan eta blokeatu %5 behi-serum albuminan (PBSn) 2 orduz giro-tenperaturan.Ondoren, zelulak gau osoan inkubatu ziren 4 °C-tan ASC (1:100 diluzioa) edo NLRP3 (1:100 diluzioa), hurrenez hurren, eta Cy3 etiketatutako ahuntz-untxiaren aurkako IgG (H+L) (1:400; EarthOx) aurkako antigorputz nagusiekin. , San Frantzisko, CA, AEB) edo FITC-rekin konjugatutako ahuntz-saguaren aurkako IgG (1:400; Earthox) gauean 37 °C-tan ilunpetan ordubetez.Nukleoak Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Txina) tindatu ziren 5 minutuz eta fluoreszentzia mikroskopioan behatu ziren (Olympus Corporation, Tokio, Japonia).
Saguak lau taldetan banatu ziren (n = 7 talde bakoitzean): (i) PBSz tratatutako kontrol negatibo taldea (PBS soilik; 100 µl/sagu PBS gavage eta 3 ordu geroago 100 µl/saguaren PBS eguneroko injekzio intraperitonealaren bidez)., etengabe 7 egunez);(ii) MCC950 inhibitzailearekin tratatutako kontrol negatiboko taldea [27] (100 µl/sagu PBS gavage bidez, 3 ordu geroago, 10 mg/kg gorputz-pisua [BW] MCC950 [PBS-n] egunero administratu zen intraperitonealki, 7 eguneko iraupena);(iii) G. duodenalis cyst infekzio-taldea (1,5 x 106 kiste/sagu gavage bidez, 3 ordu geroago, 100 μl/sagu PBS peritoneal barneko egunero 7 egunetan);(iv) G. duodenalis cyst infekzio-talde konbinatua MCC950 inhibitzaileen tratamendu-taldea (1,5 × 106 kisteak/sagua gavage bidez, 10 mg/kg gorputz-pisua MCC950 intraperitonealki egunero 7 egunetan 3 ordutan).Sagu bakoitzaren gorputz-pisua egunero kontrolatu zen eta sagu guztiak eutanasia egin zituzten 7. egunean.Hartutako duodenoa (3 cm-ko luzera) zati txikitan moztu zen 1 ml PBStan, kisteak gau osoan suntsitu ziren PBSn 4 °C-tan eta G. duodenalis trofozoitoak.Duodeno freskoa (1 cm-ko luzera) hematoxilina eta eosina (H&E) tindatzeko isolatu zen.
Saguak bi taldetan banatu ziren: (i) MOCK kontrol taldea eta (ii) MCC950 inhibitzaile taldea.Talde bakoitzean bost tratamendu zeuden (n = 7/tratamendu-taldea): (i) PBS tratamenduaren kontrol negatibo taldea (PBS bakarrik; 100 µl/sagu PBS, muskulu barneko (IM) injekzioa (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) kontrol-talde negatiboa (100 µg/saguaren DNA, muskulu barneko injekzio bidez) (iii) G. duodenalis cyst infekzioaren kontrol-talde positiboa (1,5 x 106 kisteak/saguaren bidez) (iv) a; pcDNA3.1(+)-alfa-2 plasmidoarekin tratatutako taldea (100 μg/saguaren DNA, muskulu barneko injekzio bidez), eta (v) pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 plasmidoarekin (100 μg/saguarekin tratatutako talde bat). DNA, 12 ordu igaro ondoren, MCC950 inhibitzaile taldeko saguek MCC950 (10 mg/kg gorputz-pisua) egunero injekzio intraperitoneal bat jaso zuten 7 egunez, eta MOCK taldeko saguek PBS tratamenduaren bolumen berdina jaso zuten bitartean. Odol laginak izan ziren. begi-globoetako saguetatik bildu eta gauean 4 °C-tan utzitako serum-laginak isolatu ziren entzimekin lotutako immunosorbent-ensayoa (ELISA) eta IL-1β mailen neurketak erabiliz.
Hogeita hamabost sagu bost taldetan banatu ziren (n=7/talde).1. taldea PBSrekin tratatutako kontrol negatiboko talde bat izan zen: saguek 100 μl PBS jaso zituzten muskulu barnean eta 3 egun geroago gavage bidez.2. taldea G. duodenalis kisteekin infektatutako kontrol talde positibo bat da: saguei 100 μl PBS injektatu zitzaien, eta 3 egun geroago 1,5 x 106 kiste/saguaren barnean injektatu zitzaizkien.Hirugarren taldea - pcDNA3.1(+) plasmidoen immunizazioa duodenoko kisten infekziorako kontrol talde batekin konbinatuta: saguek 100 μg DNA plasmido pcDNA3.1(+)(im) jaso zituzten ahoz, 1.5 × 106 kiste/sagua 3 hainbat aldiz. egunak.4. eta 5. taldeak pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina plasmidoa edo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina plasmidoa G. duodenalis cyst infekzioarekin konbinatuta zeuden.Talde esperimentala: saguek 100 µg pcDNA3 jaso zituzten.1(+)-giardine plasmidoaren DNA (im), gero 3 egun geroago, 1,5 × 106 kiste/sagu injektatu ziren gavage bidez.Sagu bakoitzaren gorputzaren pisua kontrolatu zen G. duodenalis kista hoditik sartu ondoren.Duodeno freskoa bildu zen parasitoen karga neurtzeko eta HE tindaketa aztertzeko.
Aldaketa histopatologikoak aurretik argitaratutako prozedura baten arabera aztertu ziren [30].Duodeno freskoa ehun-zelulen finkatzailearekin finkatu zen, parafinan txertatuta, 4 μm-ko ataletan moztu, H&Ez tindatu eta argi mikroskopioan aztertu zen.Zazpi sagu independenteren zazpi ehun-ataletako aldaketa patologiko adierazgarriak tratamendua ezagutzen ez zuen patologo batek ebaluatu zituen eta 200x handipenarekin harrapatu zituen.Villien luzera eta kripten sakonera neurtu ziren, aurretik deskribatutako metodoen arabera.
Emaitzak in vitro eta in vivo hirukoiztuta lortu ziren.Grafikoak GraphPad Prism 7.00 erabiliz sortu dira (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, AEB).Bi taldeen arteko desberdintasunak t-testaren bidez aztertu ziren, eta ≥3 taldeen arteko ezberdintasunak, berriz, norabide bakarreko analisiaren (ANOVA) SPSS softwarea erabiliz (22.0 bertsioa; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, AEB).Datuak bariantza homogeneotasuna aztertzeko Levene-ren proba erabiliz eta ondoren Bonferroni-ren post hoc probaz (B).Esanguratasuna P<0,05, P<0,01 eta P<0,001 gisa adierazten da (ez esanguratsua [ns]) (P>0,05).
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes-en (KEGG) GEV proteomikaren aurreko azterketak erakutsi zuen helburu askok hanturazko seinaleztapen-bideen aktibazioan parte har dezaketela [13].Bi helburu itxaropentsu aukeratu ditugu, alfa-2 eta alfa-7.3 giardinak, molekula hauek anplifikatu eta pcDNA3.1(+) adierazpen eukariotoaren bektorea eraikitzeko erabili.Sekuentziatu ondoren, pcDNA3.1(+)-alfa-2 eta alfa-7.3 giardina adierazpen-plasmido birkonbinatzaileak saguaren makrofago peritoneal primarioetan transfektatu ziren, eta hanturaren caspase-1 p20 sinadura proteina (kaspasa-1 aktibatuaren zati bat) identifikatu zen. hantura eragin dezaketen gako molekulak argituz.Emaitzek erakutsi zuten alfa-2 eta alfa-7.3 giardinak p20 caspasa-1 adierazpena GEVren antzekoa eragin dezaketela.Tratatu gabeko kontrol negatiboan (PBS soilik) eta pcDNA3.1 (+) plasmidoen kontrolean ez zen inolako eraginik aurkitu caspasa-1 aktibazioan (1. Irudia).
p20 caspasa-1 aktibazioa pcDNA3.1(+)-alfa-2 eta alfa-7.3 giardinen neurketa.PCDNA3.1(+)-alfa-2 eta alfa-7.3 giardinak (errei bakoitzaren gainean) espresio eukariotoen plasmido birkonbinatzaileak saguaren makrofago peritoneal primarioetan transfektatu ziren eta 24 ordu geroago bildu ziren hazkuntza gainditzaileak.Western blotting erabili zen sinadura caspase-1 p20 inflammasome proteinaren adierazpen maila neurtzeko.PBS-bakarrik tratamendu taldea (C erreia) eta pcDNA3.1(+) monoterapia taldea (pcDNA3.1 erreia) kontrol negatibo gisa erabili ziren, eta GEV tratamendu taldea kontrol positibo gisa.Proteina birkonbinatzailearen adierazpena proteina bakoitzean histidina etiketa bat detektatuz baieztatu zen, eta espero ziren proteina-bandak alfa-2 giardina (38,2 kDa) eta alfa-7,3 giardina (37,2 kDa) ziren.GEV, Giardia duodenum zelulaz kanpoko besikulak, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearizatutako bektorea, SUP, gainnatzailea
Alfa-2 giardinak eta alfa-7.3 giardinak p20 caspase-1 adierazpena eragiten duten eta NLRP3 ostalariaren hanturazko erantzuna aktibatzen duten ala ez zehazteko, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine eta pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardina saguaren makrofago peritoneal primarioetan transfektatu zen DNA plasmido birkonbinatzailearekin, eta NLRP3 hanturazko proteina gakoen adierazpen, lokalizazio eta oligomerizazio mailak zehaztu ziren.Esperimentu honetan, GEV kontrol talde positibo gisa erabili zen, eta tratamendurik gabeko taldea (PBS soilik) edo pcDNA3.1(+) transfekzio tratamendu taldea izan zen talde negatiboa.Emaitzek erakutsi zuten, GEV taldean bezala, giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 eta giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 plasmidoen DNA birkonbinatzaileak NLRP3, pro-IL-1β eta NLRP3-ren gorako erregulazioa eragin zuela. procaspase-1 eta caspase-1 aktibazioa (2a. irudia).Horrez gain, bi giardinek IL-1β jariatze esanguratsua eragin zuten (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alfa-2 giardina: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alfa-7,3 giardina: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (2b irudia).ASC proteina gehienak monomerikoak ziren tratamendurik gabeko taldean edo pcDNA3.1(+) plasmidoarekin transfektatutako tratamendu taldean, pcDNA3.1(+)-alfa-2 edo pcDNA3.1(+)-alfa-ren aldean. 7.3 giardina.ASC oligomerizazioa GEV kontrol positiboaren talde edo taldearen DNA plasmido birkonbinatzailean gertatu zen, forma oligomero bat erakutsiz (2c irudia).Aurretiazko datu hauek iradokitzen dute alfa-2 giardinak eta alfa-7,3 giardinak NLRP3 hanturaren aktibazioa eragin dezaketela.ASC eta NLRP3 lokalizazioari buruzko ikerketa immunofluoreszenteek erakutsi zuten kontrol negatiboko taldean, ASC proteina zitoplasman zehar sakabanatuta zegoela eta puntu seinale gisa agertzen zela pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinarekin edo pcDNA3rekin estimulatzean.1(+)-alfa-7,3 giardina taldea edo GEV kontrol positiboa taldea (2d irudia).Kontrol negatiboan eta plasmidoekin tratatutako pcDNA 3.1 taldeetan, NLRP3 proteinaren seinalea ez zen detektatu, eta seinale fluoreszente bat, berriz, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinari edo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3ari erantzunez. detektatu zen..giardina zitoplasman edo HEV estimulatzean aurkitzen dira (2e. irudia).Datu hauek, gainera, G. duodenalis giardin alfa-2 eta giardin alfa-7.3-k NLRP3 inflamasoma aktibatzen dutela saguaren makrofago peritoneal primarioetan.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin eta pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin-ek NLRP3 inflamasoma aktibatzen dute saguaren makrofago peritonealetan.PCDNA3.1(+)-alfa-2 giardin eta pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin espresio eukariotiko birkonbinatzaileak transfektatu makrofago eta zelula peritoneal primarioetan, edo bildu gainnatzailea 24 orduko epean adierazpena, oligomerizazioa aztertzeko. , jariapena.eta hanturazko proteina gakoen lokalizazioa.PBS-bakarrik (C) taldea eta pcDNA3.1(+) tratamendu bakarreko taldea erabili ziren kontrol negatibo gisa, eta GEV tratamendu taldea talde positibo gisa.a NLRP3 hanturazko proteinak, NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 eta p20 caspase-1 barne, Western blotting bidez detektatu ziren.b Gainnanteetan IL-1β-ren jariatze-mailak zehaztu ziren entzimekin loturiko immunosorbent test (ELISA) erabiliz.Kontrol-taldeen eta talde esperimentalen arteko desberdintasunak norabide bakarreko analisiaren (ANOVA) bidez aztertu ziren SPSS softwarearen 22.0 bertsioa erabiliz.Asteriskoek **P<0,01 eta ***P<0,001 taldeen arteko alde nabarmenak adierazten dituzte.c Pelletetan ASC oligomerizazio-mailak DSS gurutzaketa-analisiaren bidez zehaztu ziren, eta zelula-lisatuetako ASC mailak karga-kontrol gisa erabili ziren.d ISC lokalizazioaren bistaratzea immunofluoreszentzia erabiliz.e Immunofluoreszentzia erabili zen NLRP3ren lokalizazioa ikusteko.ASC, speck-like proteina apoptotikoa;IL, interleukina;NLRP3, nukleotidoen lotura-oligomerizazioaren antzeko 3. errezeptorea;ns, ez da esanguratsua (P > 0,05)
Bai G. duodenalisek bai jariatzen dituen GEVek NLRP3 inflamasoma aktibatzen dute eta ostalariaren hanturazko erantzunak in vitro erregulatzen dituzte.Beraz, NLRP3 inflamasomaren papera G. duodenalis-en patogenikotasunean ez dago argi.Gai hau ikertzeko, G. duodenalis cyst-arekin infektatutako saguen eta G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitzaile tratamenduarekin infektatutako saguen artean esperimentu bat diseinatu dugu eta G. duodenalis cyst-arekin infektatutakoan NLRP3 inflamasomaren adierazpena alderatu dugu.3a irudian esperimentuaren eskema zehatza ageri da.Tratamendu-talde desberdinetako saguen gorputz-pisuaren aldaketak kisteak infekzioaren ondoren 7 egunez kontrolatu ziren, eta emaitzak 3b irudian ageri dira.PBS puruarekin tratatutako taldearekin alderatuta, emaitzek erakutsi zuten (i) G. duodenalis kistez infektatutako saguen gorputz-pisua gutxitu egin zela infekzioaren ondorengo 3. egunetik 7ra;(ii) MCC950 inhibitzailearekin tratamenduak ez zuen eragin handirik izan saguen gorputz-pisuan..Infekzio bakarreko taldearekin alderatuta, MCC950-rekin tratatutako duodenoko infekzio taldearen BW maila ezberdinetan gutxitu zen (1. eguna: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; 2. eguna: ANOVA, F (3, 24). ) = 0,4602, P<0,0001 3. eguna: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010 4. eguna: ANOVA, F (3, 24) = 1,683, P = 0,0052, F (3, 24)=0,6497, P=0,0645 6. eguna: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; 7. eguna: ANOVA, F (3, 24) = 2,893, P = 0,0202;Datu hauek frogatzen dute NLRP3 inflamasomak duodenoaren infekzioaren hasierako faseetan (2-4 egun) saguak pisu galera nabarmenetatik babesten dituela.Ondoren, G. duodenalis trofozoitoak duodenoko garbiketa-likidoan detektatzea izan dugu helburu eta emaitzak 3c irudian ageri dira.G. duodenalis cyst infekzio taldearekin alderatuta, duodenoko trofozoitoen kopurua nabarmen handitu zen NLRP3 inflamasoma blokeatu ondoren (t (12) = 2.902, P = 0.0133).HErekin tindatutako duodeno-ehunek PBS eta MCC950-rekin bakarrik tratatutako kontrol negatiboarekin alderatuta, erakutsi zuten: (i) G. duodenalis cyst infekzioak duodeno-billoetan kalteak eragin zituen (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P=0.0488. ) eta kripta atrofia (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) G. duodenalis kisteekin infektatutako eta MCC950 inhibitzaileekin tratatutako saguen duodenoa.duodenal-billiak kaltetuta eta hilda zeuden (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) atrofia eta kripta adarkadurarekin (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (3d- irudia). f) .Emaitza hauek iradokitzen dute NLRP3 inflamasomak G. duodenalis-en patogenizitatea murrizteko zeregina duela.
NLRP3 inflamasomaren papera Giardia duodenum infekzioan.Saguei gavage egin zitzaien (iv) duodenokoko kisteekin eta ondoren MCC950arekin edo gabe tratatu ziren (ip).PBS edo MCC950 duten tratamendu bakarreko taldeak kontrol gisa erabili ziren.Talde esperimentala eta tratamendu erregimena.b Tratamendu-talde ezberdinetako saguen gorputz-pisua 7 egunez kontrolatu zen.G. duodenalis infekzio taldearen eta G. duodenalis + MCC950 infekzioaren tratamendu taldearen arteko aldea t-testaren bidez aztertu zen SPSS softwarearen 22.0 bertsioa erabiliz.Asteriskoek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte *P<0,05, **P<0,01 edo ***P<0,001.c Zama parasitoa duodenoko garbiketa-likidoaren trofozoito kopurua zenbatuta zehaztu zen.G. duodenalis infekzio taldearen eta G. duodenalis + MCC950 infekzioaren tratamendu taldearen arteko aldea t-testaren bidez aztertu zen SPSS softwarearen 22.0 bertsioa erabiliz.Asteriskoek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte *P < 0,05ean.d Duodeno histopatologiaren hematoxilina eta eosina (H&E) tindaketen emaitzak.Gezi gorriak villien kalteak adierazten ditu, gezi berdeek kripten kalteak adierazten dituzte.Eskala-barra: 100 µm.e, f Duodenal malosen altueraren eta saguaren kripta altueraren azterketa estatistikoa.Asteriskoek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte *P<0,05 eta **P<0,01.Emaitzak 7 esperimentu biologiko independenteetatik hartu dira.BW, gorputzaren pisua;ig, erditze barruko bidea;ip, peritoneal barruko erditze-bidea;ns, ez da esanguratsua (P > 0,05);PBS, fosfato buffered saline;WT, basati mota
IL-1β jariatzea hantura aktibatzeko ezaugarria da.G. duodenalis alfa-2 giardinak eta alfa-7.3 giardinak NLRP3 ostalariaren inflamasoma in vivo aktibatzen duten zehazteko, tratatu gabeko WT saguak (faltsu taldea) eta NLRP3 inflamasoma blokeatutako saguak (MCC950 inhibitutako tratamendu taldea) erabili ditugu.Esperimentuaren eskema zehatza 4a irudian ageri da.Talde esperimentalak PBS, G. duodenalis cyst tratamendua gavage bidez tratatutako saguak, pcDNA3.1 muskulu barneko injekzioa eta pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine edo pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine muskulu barneko injekzioa izan ziren.Plasmido birkonbinatzailearen muskulu barneko administrazioaren ondorengo 7. egunean, seruma bildu eta talde bakoitzean IL-1β maila zehaztu zen.4b irudian erakusten den bezala, MOCK taldean: (i) PBS taldearekin alderatuta, pcDNA3.1 tratamenduak ez zuen eragin handirik izan IL-1β jariatzean (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), ordea, IL-β jariapena nabarmen igo zen G. duodenalis cyst taldean (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine eta pcDNA3.1- Alfa-7.3 giardinaren muskulu barneko injekzioak IL-1β serumaren mailak nabarmen handitu zituen (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardinak IL -1β jariatze maila altuak eragin zituen pcDNA3.1-alpha-2 giardine muskulu barneko injekzio taldean (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .MCC950 tratamendu-taldeko talde bakoitzarekin eta MOCK taldeko taldearekin alderatuta: (i) PBS kontrol-taldean IL-1β jariatze-mailak eta pcDNA3.1 kontrol-taldean gutxitu egin ziren neurri batean MCC950 inhibitzailea blokeatu ondoren, baina aldea ez zen. esanguratsua (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) MCC950 blokeatu ondoren., IL-1β jariapena nabarmen murriztu zen G. duodenalis cyst infektatutako taldean, pcDNA3.1-alpha-2 giardine taldean eta pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine taldean (G. duodenalis: ANOVA, F(9). , 58) = 3.540, P = 0.0120 pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardina: ANOVA, F (9, 58). ) = 3,540, P = 0,0164).Emaitza hauek iradokitzen dute alfa-2 giardinak eta alfa-7.3 giardinak NLRP3 inflamasomaren aktibazioa in vivo bideratzen dutela.
pcDNA3.1(+)-giardinak NLRP3 ostalariaren inflamasoma in vivo aktibatzen du.Saguak (IM) immunizatu ziren pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine edo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinearen adierazpen eukariotiko birkonbinatzailearekin eta, ondoren, MCC950 (ip; MCC950 taldea) edo ez (dummy taldearekin) tratatu ziren. ).PBS edo pcDNA3.1(+) plasmidoen tratamendu-taldea kontrol negatibo gisa erabili zen, G. duodenalis cyst tratamendu-taldea kontrol positibo gisa.Talde esperimentala eta tratamendu erregimena.b IL-1β-ren serum-mailak saguetan 7. egunean neurtu ziren ELISA saiakeraren bidez.MOCK taldeko taldeen arteko ezberdintasunak norabide bakarreko ANOVA erabiliz aztertu ziren, eta MOCK taldearen eta MCC950 taldearen arteko ezberdintasunak SPSS softwarearen 22.0 bertsioaren t-testaren bidez aztertu ziren.Asteriskoek tratamendu taldeen arteko desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte MOCK taldean, *P<0,05 eta ***P<0,001;Dolar zeinuek ($) MOCK taldeko talde bakoitzaren eta MCC950 taldearen arteko desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte P<0,05ean.Zazpi esperimentu biologiko independenteren emaitzak.i, muskulu barneko injekzioa, ns, ez da esanguratsua (P > 0,05)
NLRP3 ostalariaren inflamasomaren alfa-2 eta alfa-7.3 giardinaren bidezko aktibazioa G. duodenalis infektibitatean duen eragina ikertzeko, WT C57BL/6 saguak erabili genituen eta alfa-2 giardina eta alfa-7.3 giardina injektatu genituen.plasmidoa muskulu barnean injektatu zen, 3 egun igaro ondoren G. duodenalis kistearen gastrikoko hoditik, eta ondoren saguak 7 egunez behatu ziren.5a irudian esperimentuaren eskema zehatza ageri da.Sagu bakoitzaren gorputz-pisua egunero neurtu zen, duodeno-ehun freskoaren laginak jaso ziren hodi gastriko baten bidez administratu ondorengo 7. egunean, trofozoito kopurua neurtu eta aldaketa histopatologikoak ikusi ziren.5b irudian ikusten den bezala, elikatzeko denbora handituz, talde bakoitzeko saguen BW pixkanaka handitu zen.Saguen MT gutxitzen hasi zen G. duodenalis kisteak barne gastrikoen administrazioaren ondorengo 3. egunean, eta gero pixkanaka handitzen joan zen.Alfa-2 giardina eta alfa7.3 giardinearen muskulu barneko injekzioak eragindako NLRP3 inflamasomaren aktibazioa saguetan pisu galera nabarmen gutxitu zuen (1. eguna: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0,9754 1. eguna: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1,399, P = 0,9987 2. eguna: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F ( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 2. eguna: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardina, ANOVA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 3. eguna: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA ( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 3. eguna: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardina, ANOVA, F (4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083 4. eguna: pcDNA3.1-alpha-2 giardine; , F (4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, 4. eguna: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, 5. eguna: pcDNA3.1-alpha - 2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 5. eguna: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 6. eguna: pcDNA3 ,1 - alfa-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, 6. eguna: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;7. eguna: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 7. eguna: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Zama parasitoa duodenoan ebaluatu zen (5c. irudia).Tratatu gabeko kontrol positiboarekin eta pcDNA3.1 bektore hutsarekin injektatutako taldearekin alderatuta, G. duodenalis trofozoitoen kopurua nabarmen murriztu zen α-2 giardina eta α-7,3 giardina (pcDNA3.1-alpha) injektatutako taldeetan. -2 giardina : ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina: ANOVA, F (3, 24) = 1,209, P<0,0001).Gainera, giardine alfa-7.3 giardine alfa-2 baino babes handiagoa izan zen saguetan (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).HE tindaketaren emaitzak irudian agertzen dira.5d–f.Alfa-2 giardinearekin eta alfa-7.3 giardinearekin injektatutako saguek ehun duodenoko lesio gutxiago izan zituzten, villus kaltearen ondorioz, G. duodenalis-ekin injektatutako saguekin eta pcDNA3 bektore huts batekin konbinatuta G. duodenalis-ekin injektatutako saguekin alderatuta.(pcDNA3.1-alfa-2 giardina: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0.0035 edo P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardina: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0,0028 edo P = 0,0055) eta kripta atrofia murriztua (pcDNA3.1-alpha-2 giardina: ANOVA, F (3, 24) = 1.470, P = 0.0264 edo P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardina: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 edo P = 0,0191).Emaitza hauek iradokitzen dute alfa-2 giardinak eta alfa-7,3 giardineak G. duodenalis-en infektibitatea murrizten dutela NLRP3 inflamasoma in vivo aktibatuz.
pcDNA3.1(+)-giardinen papera G. duodenalis infekzioan.Saguak immunizatu ziren (IM) pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine edo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinezko adierazpen eukariotoen plasmido birkonbinatzaileekin eta gero G. duodenalis kisteak (ig) jarri zituzten.PBS taldea eta pcDNA3.1(+) + duodenal cyst tratamendu taldea kontrol negatibo talde gisa erabili ziren, eta duodenal cyst tratamendu taldea kontrol talde positibo gisa erabili zen.Talde esperimentala eta tratamendu erregimena.b Tratamendu-talde ezberdinetako saguen MT-a kontrolatu zen erronkaren ondorengo 7 egunetan.Asteriskoek G. duodenalis taldeko eta pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine taldeko taldeen arteko desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte, *P < 0,05, **P < 0,01 eta ***P < 0,001;dolarraren zeinuak ($) G. duodenalis talde bakoitzaren eta pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine taldearen arteko alde nabarmena adierazten du, $$P<0,01 eta $$$P<0,001.c Zama parasitoa duodenotik (3 cm-ko luzera) duodenoko 1 ml-ko trofozoito-kopurua zenbatuta eta duodenoko cm-ko parasito-kopuru gisa adierazi zen.G. duodenalis infekzio taldearen, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine taldearen eta pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine taldearen arteko desberdintasunak norabide bakarreko ANOVAren bidez aztertu ziren SPSS softwarearen 22.0 bertsioa erabiliz.Asteriskoek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte **P<0,01 eta ***P<0,001.d Duodenoko aldaketa histopatologikoak.Gezi gorriak villien kalteak adierazten ditu, gezi berdeek kripten kalteak adierazten dituzte.Eskala-barra: 100 µm.e, f Saguaren duodenalaren altueraren (e) eta kripten altueraren (f) analisi estatistikoa.1d irudiko taldeen arteko desberdintasunak norabide bakarreko ANOVAren bidez aztertu ziren SPSS softwarearen 22.0 bertsioa erabiliz.Asteriskoek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte *P<0,05 eta **P<0,01.Zazpi esperimentu biologiko independenteren emaitzak.ns, ez da esanguratsua (P > 0,05)
Giardia duodenum giardiasia eragiten duen gizakien eta beste ugaztun batzuen hesteetako bizkarroi ezaguna da.2004an, OMEren Ezkutaturiko Gaixotasunen Ekimenean sartu zen 6 urtean zehar izan zuen prebalentzia handiagatik, batez ere egoera sozioekonomiko baxuko komunitateetan [32].Berezko immunitate-sistemak zeregin kritikoa du G. duodenalis infekzioaren erantzun immunologikoan.Sagu makrofagoek G. duodenalis irentsi eta hiltzen dutela jakinarazi dute zelulaz kanpoko tranpak askatuz [33].Gure aurreko ikerketek erakutsi dute G. duodenalis-ek, zelulaz kanpoko parasito ez-inbaditzaileak, p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 eta NLRP3 hanturazko seinaleztapen-bideak aktibatzen dituela saguaren makrofagoetan ostalariaren hantura-erantzunak erregulatzeko, eta GEV askatuak prozesu hau hobetu dezake.13], 24].Hala ere, GEVn NLRP3 inflamasomak erregulatutako hanturan parte hartzen duten PAMP zehatzak eta NLRP3 inflamasomak giardiasian duen papera argitu gabe daude.Bi galdera hauek argitzeko, ikerketa hau egin dugu.
NLRP3 inflamasoma zelula immuneen zitoplasman dago eta hainbat partikulak aktibatu dezakete, hala nola azido uriko kristalek, toxinak, bakterioak, birusak eta parasitoak.Bakterioen ikerketetan, toxinak hanturazko sentsoreak aktibatzen dituzten PAMP gako gisa identifikatu dira, hantura eta zelulen heriotza eragiten dutenak [34].Egitura askotariko toxina batzuek, hala nola, Staphylococcus aureus-eko hemolisina [35] eta Escherichia coli [36], enterotoxinako hemolisina BL (HBL) (NHE) [37], NLRP3 hanturaren aktibazioa eragiten dute.Azterketa biralek frogatu dute birulentzia proteinak, hala nola SARS-COV-2 (E) proteina [38] eta Zika birusaren NS5 proteina [39] NLRP3 hartzaileak aitortutako PAMP garrantzitsuak direla.Parasitoen ikerketetan, parasito asko ostalariaren inflamasomaren aktibazioarekin lotuta daudela jakinarazi da, hala nola Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] eta Leishmania [42].GRA35, GRA42 eta GRA43 proteina pikor trinkoak, Toxoplasma gondii-ren birulentziarekin lotutakoak, Lewis arratoi makrofagoetan piroptosiaren indukziorako beharrezkoak dira [43].Horrez gain, Leishmaniako zenbait ikerketek NLRP3 inflamasoman parte hartzen duten molekula indibidualetan zentratu dira, hala nola parasitoen mintz lipofosfoglikanoa [44] edo zink metaloproteasa [45].Anexin-itxurako alfa-giardin geneen artean, alfa-1 giardina txerto-hautagai potentziala dela frogatu da sagu-eredu batean G. duodenalis-en aurkako babesa ematen duena [18].Gure ikerketan, G. duodenalis birulentzia-faktoreak alfa-2 eta alfa-7,3 giardinak hautatu ditugu, giardia-ren bakarrak baina nahiko gutxiago jakinarazi direnak.Bi helburu-gene hauek pcDNA3.1(+) adierazpen-sistema eukariotikoen bektorean klonatu ziren hanturaren aktibazioa aztertzeko.
Gure saguaren ereduan, moztutako caspasa zatiek hanturazko aktibazio-markatzaile gisa balio dute.Estimulazioan, NLRP3-k ASCrekin elkarreraginean jarduten du, prokaspasak erreklutatzen ditu eta pro-IL-1β eta pro-IL-18 pro-IL-1β eta pro-IL-18 helduetan, hurrenez hurren -18, mozten dituzten kapaspasak sortzen ditu.Hanturazko kaspasak (caspases-1, -4, -5 eta -11) berezko defentsarako funtsezkoak diren zisteina-proteasen familia kontserbatu bat dira eta hanturan eta zelulen heriotza programatuan parte hartzen dute [46].Caspasa-1 inflamasoma kanonikoek aktibatzen dute [47], eta kaspasak-4, -5 eta -11, berriz, inflamasoma atipikoen eraketan zehar mozten dira [48].Ikerketa honetan, saguaren makrofago peritonealak eredu gisa erabili ditugu eta p20 caspase-1 cleaved caspase-1 ikertu dugu ostalariaren NLRP3 hantura aktibatzeko markatzaile gisa G. duodenalis infekzioaren ikerketetan.Emaitzek erakutsi zuten alfa-giardina asko hanturaren aktibazio tipikoaren erantzule direla, eta hori bat dator bakterioetan eta birusetan parte hartzen duten birulentzia-molekula gakoen aurkikuntzarekin.Hala ere, gure azterketa aurretiazko pantaila bat baino ez da eta badira inflamasoma ez-klasikoak aktibatu ditzaketen beste molekula batzuk, gure aurreko ikerketak G. duodenalis infekzioan inflamasoma klasikoak eta ez-klasikoak aurkitu baitzituen [13].Sortutako p20 caspase-1 NLRP3 inflamasomarekin erlazionatuta dagoen ala ez zehazteko, alfa-2 eta alfa-7.3 giardinak saguaren makrofago peritonealetan transfektatu genituen molekula-proteinen adierazpen-mailak eta ASC oligomerizazio-mailak zehazteko, bi α-giardinak aktibatzen direla baieztatuz. inflamasoma NLRP3.Gure emaitzak apur bat desberdinak dira Manko-Prykhoda et al.-enekin alderatuta, Caco-2 zelulen estimulazioak G. muris edo E. coli EPEC anduiekin bakarrik NLRP3, ASC eta caspase-1-en fluoreszentzia-intentsitatea handitu dezakeela jakinarazi zuten. esanguratsua ez bada ere, G. muris eta E. coli-ren koestimulazioak hiru proteinen mailak nola igo zituen bitartean [49].Desadostasun hori Giardia espezieen, zelula-lerroen eta zelula primarioen aukeraketan izandako desberdintasunengatik izan daiteke.In vivo azterketak ere egin ditugu MCC950 erabiliz 5 asteko WT C57BL/6 sagu emeetan, zeinak G. duodenalis jasaten dutenean.MCC950 molekula txiki indartsu eta selektiboa NLRP3 inhibitzaile bat da, kontzentrazio nanomolarretan NLRP3 aktibazio kanonikoa eta ez-kanonikoa blokeatzen duena.MCC950-k NLRP3 aktibazioa inhibitzen du, baina ez du eragiten AIM2, NLRC4 eta NLRP1 hantura-bideen edo TLR seinaleztapen-bideen aktibazioan [27].MCC950-k NLRP3 aktibazioa blokeatzen du baina ez du NLRP3 abiarazpena, K+ isurketa, Ca2+ fluxua edo NLRP3 eta ASCren arteko elkarrekintza eragozten;horren ordez, NLRP3 inflamasomaren aktibazioa inhibitzen du ASC oligomerizazioa blokeatuz [27].Hori dela eta, MCC950 in vivo ikerketa batean erabili dugu giardina injektatu ondoren NLRP3 inflamasomaren eginkizuna zehazteko.Caspasa-1 p10 aktibatuak pro-IL-1β eta pro-IL-18 proinflamatorio zitokinak mozten ditu IL-1β eta IL-18 helduetan [50].Ikerketa honetan, giardinearekin tratatutako saguen serum IL-1β mailak MCC950dun edo gabe NLRP3 inflamasoma aktibatuta zegoen ala ez adierazteko erabili ziren.Espero zen bezala, MCC950 tratamenduak IL-1β serumaren maila nabarmen murriztu zuen.Datu hauek argi eta garbi erakusten dute G. duodenalis giardin alfa-2 eta giardin alfa-7.3 gai direla NLRP3 saguaren inflamasoma aktibatzeko.
Azken hamarkadan pilatutako datu esanguratsuek frogatu dute IL-17A G. muris-en aurkako immunitatearen erregulatzaile nagusia dela, IL-17RA seinaleztapena eraginez, mikrobioen aurkako peptidoak sortuz eta osagarriaren aktibazioa erregulatuz [51].Hala ere, Giardia infekzioa maizago gertatzen da heldu gazteengan, eta jakin izan da sagu gazteetan Giardia infekzioak ez duela IL-17A erantzuna aktibatzen bere babes-efektua gauzatzeko [52], ikertzaileek beste Giardia immunomodulatzaile batzuen bilatzera bultzatuz.helmintoen infekzioaren mekanismoak.Berriki egindako ikerketa baten egileek jakinarazi dutenez, G. muris-ek NLRP3 inflamasoma aktiba dezake E. coli EPEC-ek, mikrobioen aurkako peptidoen ekoizpena sustatzen duela eta bere atxikimendu-ahalmena eta heste-traktuko trofozoito-kopurua murrizten duela, eta, ondorioz, kolonaren larritasuna murrizten du. baziloek eragindako gaixotasunak [49].NLRP3 inflamasoma hainbat gaixotasunen garapenean parte hartzen du.Ikerketek frogatu dute Pseudomonas aeruginosa-k makrofagoetan autofagia abiarazten duela zelulen heriotza saihesteko, eta prozesu hori NLRP3 inflamasomaren aktibitatearen araberakoa da [53].N. caninum-entzat, NLRP3 inflamasomaren aktibazio-espezie erreaktiboak oxigeno-espezieak ostalariaren erreplikazioa mugatzen du, helburu terapeutiko potentziala bihurtuz [9].Paracoccidioides brasiliensis-ek saguaren hezur-muinean eratorritako zelula dendritikoetan NLRP3 inflamasomaren aktibazioa eragiten duela aurkitu da, eta ondorioz, ostalariaren defentsan eginkizun kritikoa duen IL-1β hanturazko zitokina askatzen da [10].Hainbat Leishmania espeziek, L. amazonensis, L. major, L. braziliensis eta L. infantum chagasi barne, NLRP3 eta ASC menpeko caspasa-1 aktibatzen dituzte makrofagoetan, baita Leishmania infekzioa ere.Parasitoen erreplikazioa hobetu egiten da NLRP3/ASC/caspase-1 genean eskasak diren saguetan [11].Zamboni et al.Leishmania infekzioak makrofagoetan NLRP3 inflamasomaren aktibazioa eragiten duela jakinarazi du, eta horrek parasitoen zelula barneko erreplikazioa mugatzen du.Horrela, Leishmaniak NLRP3 aktibazioa inhibitu dezake saihesteko estrategia gisa.In vivo ikerketetan, NLRP3 inflamasomak Leishmania ezabatzen lagundu zuen, baina ez zuen ehunetan eraginik [54].Alderantziz, helmintiasiaren ikerketetan, NLRP3 inflamasomaren aktibazioak ostalariaren babes-immunitatea kendu zuen helmintiasi gastrointestinalaren aurka [12].Shigella mundu osoan beherakoa eragiten duen bakterio nagusietako bat da.Bakterio hauek IL-1β ekoiztea eragin dezakete P2X7 hartzailearen bidezko K+ isurketaren, oxigeno-espezie erreaktiboen, azidotze lisosomikoen eta kalte mitokondrialaren bidez.NLRP3 inflamasomak negatiboki erregulatzen ditu makrofagoen fagozitosia eta jarduera bakterizida Shigellaren aurka [55].Plasmodium ikerketek frogatu dute Plasmodiumarekin infektatutako AIM2, NLRP3 edo caspase-1 eskaseko saguek 1 motako interferoi maila altua sortzen dutela eta Plasmodium infekzioarekiko erresistenteagoak direla [56].Hala ere, alfa-2 giardinaren eta alfa-7.3 giardinaren eginkizuna saguetan NLRP3 hanturaren aktibazio patogenoa eragiteko ez dago argi.
Ikerketa honetan, MCC950-ren NLRP3 inflamasomaren inhibizioak BW murriztu zuen eta trofozoitoen kopurua handitu zuen saguetan hesteetako garbiketa-likidoan, eta, ondorioz, aldaketa patologiko larriagoak izan ziren duodeno-ehunean.Alpha-2 giardinak eta alfa-7.3 giardinak sagu ostalariaren NLRP3 inflamasoma aktibatzen dute, saguaren gorputzaren pisua handitzen dute, hesteetako garbiketa-likidoan trofozoitoen kopurua murrizten dute eta duodeno-lesio patologikoak arintzen dituzte.Emaitza hauek iradokitzen dute G. duodenalis-ek NLRP3 ostalariaren inflamasoma aktibatu dezakeela alfa-2 giardina eta alfa-7,3 giardinaren bidez, G. duodenalis-en patogenikotasuna murriztuz saguetan.
Kolektiboki, gure emaitzek frogatzen dute alfa-2 eta alfa-7.3 giardinek NLRP3 ostalariaren inflamasomaren aktibazioa eragiten dutela eta saguetan G. duodenalis-en infektibitatea murrizten dutela.Horregatik, molekula hauek giardiasiaren prebentziorako helburu itxaropentsuak dira.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasia: ikuspegi orokorra.Duela gutxi agerian geratu da Pat Inflamm drogekiko alergia dela.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: farmakoterapiaren berrikuspena.Botikari baten adituen iritzia.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasia, botiken erresistentzia eta helburu berrien aurkikuntza.Nahasteen droga-helburuak kutsatzen ditu.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, etab. NLRP3 inflamasoma eta hanturazko gaixotasunak.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Inflamsomaren papera hesteetako hanturan eta minbizian.Gastroenterologia.2011;141: 1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. NLRP3 inflamasomaren aktibazio kanonikoa eta atipikoa tolerantzia immunologikoaren eta hesteetako hanturaren bidegurutzean.aurre-immunea.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, etab.ROS bidezko NLRP3 inflamasomaren aktibazioa N. caninum infekzioaren erantzunean parte hartzen du.Parasito bektorea.2020;13:449.