Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Toxoplasma gondii zelula barneko protozoo parasitoa da, infektatutako ostalariaren mikroingurunea modulatzen duena eta garuneko tumoreen hazkuntzaren intzidentziarekin lotuta dagoela ezaguna da.Ikerketa honetan, Toxoplasma infekzioaren miRNA-21 exosomalak garuneko tumorearen hazkuntza sustatzen duela hipotesia dugu.Toxoplasmaz infektatutako BV2 mikrogliako exosomak ezaugarritu ziren eta U87 glioma zelulen barneratzea baieztatu zen.MikroRNA exosomikoen adierazpen-profilak Toxoplasma gondii-rekin eta tumoreen sailkapenarekin lotutako mikroRNA eta microRNA-21A-5p array-en bidez aztertu ziren.U87 glioma zeluletan tumoreekin lotutako geneen mRNA mailak ere ikertu ditugu exosometan miR-21 mailak aldatuz eta exosomek giza U87 glioma zelulen ugalketan duten eragina.Toxoplasma gondii-rekin infektatutako U87 glioma-zelulen exosometan, mikroRNA-21-aren adierazpena areagotzen da eta tumoreen aurkako geneen (FoxO1, PTEN eta PDCD4) jarduera murrizten da.Toxoplasmarekin infektatutako BV2-tik eratorritako exosomek U87 glioma-zelulak ugaltzen dituzte.Exosomek U87 zelulen hazkuntza eragiten dute saguaren tumore-eredu batean.Toxoplasmak infektatutako BV2 mikroglian miR-21 exosomal handitzeak U87 glioma zeluletan zelulen hazkuntza sustatzaile gisa funtzio garrantzitsua izan dezakeela iradokitzen dugu, tumoreen aurkako geneak beherantz erregulatuz.
2018an mundu osoan 18,1 milioi minbizi aurreratuko kasu baino gehiago diagnostikatu zirela kalkulatzen da, urtero nerbio-sistema zentraleko 297.000 tumore inguru diagnostikatu zirela (tumore guztien % 1,6)1.Aurretik egindako ikerketek erakutsi dute giza garuneko tumoreak garatzeko arrisku-faktoreak hainbat produktu kimiko, familia-historia eta buruko ekipo terapeutiko eta diagnostikoko erradiazio ionizatzaileak barne hartzen dituztela.Hala ere, ezezaguna da gaixotasun gaizto horien kausa zehatza.Mundu osoko minbizi guztien %20 inguru agente infekziosoek eragiten dute, birusak, bakterioak eta parasitoak barne3,4.Patogeno infekziosoek zelula ostalariaren mekanismo genetikoak apurtzen dituzte, hala nola DNAren konponketa eta zelulen zikloa, eta hantura kronikoa eta sistema immunologikoa kaltetu ditzakete5.
Giza minbiziarekin lotutako agente infekziosoak patogeno birikoak dira ohikoenak, giza papilomabirusak eta B eta C hepatitisaren birusak barne.Parasitoek gizakiaren minbiziaren garapenean ere izan dezakete papera.Hainbat bizkarroi espezie, hots, Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis eta Hymenolepis nana, giza minbizi mota ezberdinetan inplikatuta egon dira 6,7,8.
Toxoplasma gondii zelula barneko protozoo bat da, infektatutako zelula ostalarien mikroingurunea erregulatzen duena.Parasito honek munduko biztanleriaren %30 inguru kutsatzen duela kalkulatzen da, biztanleria osoa arriskuan jarriz9,10.Toxoplasma gondii-k ezinbesteko organoak infekta ditzake, nerbio-sistema zentrala (CNS) barne, eta gaixotasun larriak eragin ditzake, hala nola meningitis hilgarria eta entzefalitisa, batez ere immunodeprimituta dauden pazienteetan9.Hala ere, Toxoplasma gondii-k infektatutako ostalariaren ingurunea ere alda dezake immunokonpetentziak diren pertsonen zelulen hazkundea eta erantzun immunologikoak modulatuz, infekzio kroniko asintomatikoaren mantentzea eraginez9,11.Interesgarria da, T. gondii prebalentziaren eta garuneko tumoreen intzidentziaren arteko korrelazioa kontuan hartuta, zenbait txostenek iradokitzen dute T. gondii infekzio kronikoaren ondoriozko ostalari in vivoko ingurumen-aldaketak tumorearen mikroingurunearen antza dutela.
Exosomak ondoko zeluletatik eduki biologikoa, proteinak eta azido nukleikoak barne, zelula arteko komunikatzaile gisa ezagutzen dira16,17.Exosomek tumoreekin erlazionatutako prozesu biologikoetan eragina izan dezakete, hala nola, anti-apoptosia, angiogenesia eta metastasia tumorearen mikroingurunean.Bereziki, miRNAak (miRNAs), 22 nukleotido inguruko luzera duten RNA ez-kodetzaile txikiak, transkripzio osteko gene erregulatzaile garrantzitsuak dira, giza mRNAren % 30 baino gehiago kontrolatzen dutenak miRNAk eragindako isiltze konplexuaren (miRISC) bidez.Toxoplasma gondii-k prozesu biologikoak eten ditzake infektatutako ostalarietan miRNAren adierazpena kontrolatuz.Ostalariaren miRNAek seinale garrantzitsuak dituzte ostalariaren prozesu biologikoak erregulatzeko parasitoaren biziraupen-estrategia lortzeko.Beraz, T. gondii-rekin infekzioaren ondorioz ostalariaren miRNA profilaren aldaketak aztertzeak ostalariaren eta T. gondii-ren arteko elkarrekintza argiago ulertzen lagun dezake.Izan ere, Thirugnanam et al.15-ek iradoki zuen T. gondii-k garuneko kartzinogenia sustatzen duela tumorearen hazkuntzarekin lotutako ostalariaren miRNA espezifikoetan duen adierazpena aldatuz eta T. gondii-k animalia esperimentaletan gliomak sor ditzakeela aurkitu zuen.
Azterketa hau Toxoplasma BV2-rekin infektatutako ostalariaren mikroglian miR-21 exosomikoaren alterazioan zentratzen da.MiR-21 exosomal aldatuak U87 glioma zelulen hazkuntzan izan dezakeen eginkizuna ikusi dugu FoxO1/p27 nukleoaren atxikipenagatik, hau da, miR-21 gainespresatuaren xedea.
BV2tik eratorritako exosomak zentrifugazio diferentziala erabiliz lortu ziren eta hainbat metodoren bidez balioztatu ziren osagai zelularrekin edo beste besikula batzuekin kutsadura saihesteko.SDS-poliakrilamida gel elektroforesiak (SDS-PAGE) BV2 zeluletatik eta exosometatik ateratako proteinen arteko eredu desberdinak erakutsi zituen (1A irudia), eta laginak Alix-en presentzia ebaluatu zuten, proteina exosomal markatzaileen Western blotting bidez aztertu zen.Alix etiketatzea exosoma proteinetan aurkitu zen, baina ez BV2 zelula lisatuen proteinetan (1B. irudia).Horrez gain, BV2tik eratorritako exosometatik RNA araztua bioanalizatzaile baten bidez aztertu zen.18S eta 28S erribosomiko azpiunitateak oso gutxitan ikusi ziren RNA exosomikoen migrazio ereduan, garbitasun fidagarria adieraziz (1C irudia).Azkenik, transmisio-mikroskopia elektronikoak erakutsi zuen behatutako exosomak 60-150 nm inguruko tamaina zutela eta exosomaren morfologian ohikoa den kopa-itxurako egitura zutela (1D. irudia).
BV2 zeluletatik eratorritako exosomen karakterizazioa.(A) Segurtasun datuen orria.Proteinak BV2 zeluletatik edo BV2tik eratorritako exosometatik isolatu ziren.Proteinen ereduak desberdinak dira zelulen eta exosomen artean.(B) Markatzaile exosomiko baten Western blot azterketa (Alix).(C) BV2 zeluletatik eta BV2 eratorritako exosometatik RNA araztuaren ebaluazioa bioanalizatzaile baten bidez.Horrela, BV2 zeluletan 18S eta 28S erribosomiko azpiunitateak oso gutxitan aurkitu ziren RNA exosomikoan.(D) Transmisiozko mikroskopia elektronikoak BV2 zeluletatik isolatutako exosomak % 2ko uranilo azetatoarekin negatiboki tindatu zirela erakutsi zuen.Exosomak gutxi gorabehera 60-150 nm-ko tamaina eta kopa-formakoak dira (Song eta Jung, datu argitaratu gabeak).
BV2tik eratorritako exosomen barneratzea zelularra U87 giza glioma zeluletan ikusi zen mikroskopia konfokala erabiliz.PKH26 markatutako exosomak U87 zelulen zitoplasman kokatzen dira.Nukleoak DAPIrekin tindatu ziren (2A. irudia), BV2tik eratorritako exosomak ostalari-zelulek barneratu ditzaketela eta zelula hartzaileen ingurunean eragin dezaketela adieraziz.
BV2-tik eratorritako exosomak U87 glioma-zeluletan eta Toxoplasma RH-rekin infektatutako BV2-tik eratorritako exosomak U87 glioma-zelulak ugaltzea eragin zuen.(A) U87 zelulek irentsitako exosomak mikroskopio konfokalaren bidez neurtuta.U87 glioma zelulak PKH26 (gorria) markatutako exosomekin edo kontrolik gabe inkubatu ziren 24 orduz.Nukleoak DAPIz (urdinez) tindatu eta mikroskopio konfokalean behatu ziren (eskala barra: 10 μm, x 3000).(B) U87 glioma zelulen ugalketa zelularen ugalketa saiakeraren bidez zehaztu zen.U87 glioma zelulak exosomekin tratatu ziren adierazitako denboran. *P < 0,05 Student-en t testaren bidez lortu da. *P < 0,05 Student-en t testaren bidez lortu da. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 Student-en t-testaren arabera. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Student-en t-testa erabiliz lortutakoa.
BV2-tik eratorritako exosomak U87 glioma-zeluletan barneratzea baieztatu ondoren, zelulen ugalketa-saiakuntzak egin genituen, BV2tik eratorritako Toxoplasmatik eratorritako exosomen giza glioma-zelulen garapenean duten papera ikertzeko.U87 zelulak T. gondii-k infektatutako BV2 zeluletako exosomekin tratatzeak erakutsi zuen T. gondii-k infektatutako BV2-tik eratorritako exosomek U87 zelulen ugaltze nabarmen handiagoa eragiten zutela kontrolarekin alderatuta (2B. irudia).
Horrez gain, U118 zelulen hazkuntzak U87ren emaitza berdinak izan zituen, Toxoplasmak estimulatutako exosomak eragin baitzituen ugaltze mailarik handienak (datuak ez dira erakusten).Datu horietatik abiatuta, BV2-tik eratorritako Toxoplasmaz infektatutako exosomek paper garrantzitsua betetzen dutela adierazi dezakegu glioma zelulen ugalketan.
Toxoplasmak infektatutako BV2-tik eratorritako exosomek tumorearen garapenean duten eragina ikertzeko, U87 glioma zelulak injektatu genituen sagu biluzietan xenograft eredu baterako eta BV2tik eratorritako exosomak edo RHz infektatutako BV2tik eratorritako exosomak injektatu genituen.Astebeteren buruan tumoreak agertu ondoren, 5 saguko talde esperimental bakoitza tumorearen tamainaren arabera banatu zen abiapuntu bera zehazteko, eta tumorearen tamaina neurtu zen 22 egunez.
U87 xenograft eredua duten saguetan, tumorearen tamaina eta pisu nabarmen handiagoak ikusi ziren 22. egunean BV2tik eratorritako RHz infektatutako exosoma taldean (3A, B irudia).Bestalde, ez zen tumorearen tamainan alde handirik egon BV2tik eratorritako exosoma taldearen eta exosomaren tratamenduaren ondoren kontrol taldearen artean.Horrez gain, glioma zelulekin eta exosomekin injektatutako saguek ikusmenean erakutsi zuten tumore-bolumen handiena RH-rekin infektatutako BV2-tik eratorritako exosomen taldean (3C. irudia).Emaitza hauek frogatzen dute BV2-tik eratorritako Toxoplasmak infektatutako exosomek gliomaren hazkuntza eragiten dutela saguaren tumore-eredu batean.
BV2tik eratorritako exosomen onkogenesia (AC) U87 xenograft sagu eredu batean.Tumorearen tamaina (A) eta pisua (B) nabarmen handitu ziren BV2tik eratorritako RH infektatutako exosomekin tratatutako BALB/c sagu biluzietan.BALB/c sagu biluziak (C) larruazalpean injektatu ziren 1 x 107 U87 zelula Matrigel nahasketan esekita.Injekziotik sei egunera, BV2tik eratorritako exosoma 100 μg tratatu ziren saguetan.Tumorearen tamaina eta pisua adierazitako egunetan eta sakrifizioaren ondoren neurtu ziren, hurrenez hurren. *P < 0,05. *P < 0,05. * Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. * Р < 0,05. *P < 0,05.
Datuek erakutsi zuten immunitatearekin edo tumoreen garapenarekin lotutako 37 miRNA (16 gainespresatuta eta 21 behera adierazita) mikroglian nabarmen aldatu zirela Toxoplasma RH anduiarekin infekzioaren ondoren (4A. irudia).Aldatutako miRNAen miR-21en adierazpen maila erlatiboak denbora errealeko RT-PCR bidez baieztatu ziren BV2tik eratorritako exosometan, BV2 eta U87 zelulekin tratatutako exosometan.MiR-21-aren adierazpenak Toxoplasma gondii-rekin (RH tentsioa) infektatutako BV2 zeluletatik exosomen gorakada nabarmena erakutsi zuen (4B. irudia).BV2 eta U87 zeluletan miR-21 espresio-maila erlatiboak handitu egin ziren aldatutako exosomak hartu ondoren (4B. irudia).MiR-21 adierazpen-maila erlatiboak tumore-gaixoen eta Toxoplasma gondii-rekin (ME49 tentsioa) kutsatutako saguen garuneko ehunetan kontroletan baino handiagoak izan ziren (4C. irudia).Emaitza hauek in vitro eta in vivo aurreikusitako eta baieztatutako mikroRNAen adierazpen-mailen arteko desberdintasunekin erlazionatzen dira.
Toxoplasma gondii (RH) infektatutako mikroglian miP-21a-5p exosomalaren adierazpen-aldaketak.(A) T. gondii RH infekzioaren ondoren immunitatearekin edo tumorearen garapenarekin lotutako siRNAn aldaketa garrantzitsuak erakusten ditu.(B) MiR-21 adierazpen maila erlatiboak denbora errealeko RT-PCR bidez detektatu ziren BV2tik eratorritako exosometan, BV2-rekin tratatutako exosometan eta U87 zeluletan.(C) MiR-21 adierazpen-maila erlatiboak aurkitu ziren tumore-gaixoen (N=3) eta Toxoplasma gondii-rekin (ME49 tentsioa) infektatutako saguetan (N=3) garuneko ehunetan. *P < 0,05 Student-en t testaren bidez lortu da. *P < 0,05 Student-en t testaren bidez lortu da. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 Student-en t-testa erabiliz lortu da. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Student-en t-testa erabiliz lortutakoa.
RH-k infektatutako BV2 zeluletako exosomek gliomak hazi ziren in vivo eta in vitro (2, 3. irudiak).MRNA garrantzitsuak detektatzeko, tumorearen kontrako xede-geneen, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN eta programatutako zelulen heriotza 4 (PDCD4) BV2 edo RH BV2tik eratorritako exosomekin infektatutako U87 zeluletan mRNA mailak aztertu genituen.Bioinformatikako analisiak erakutsi du tumoreari lotutako hainbat geneek, FoxO1, PTEN eta PDCD4 geneek barne, miR-2121,22 lotzeko guneak dituztela.Tumorearen aurkako xede-geneen mRNA mailak RH-infektatutako BV2-tik eratorritako exosometan murriztu ziren BV2-tik eratorritako exosomekin alderatuta (5A. irudia).FoxO1ek proteina-maila murriztua erakutsi zuen RH-k infektatutako BV2-tik eratorritako exosometan BV2-tik eratorritako exosomekin alderatuta (5B irudia).Emaitza horietatik abiatuta, RH-k infektatutako BV2tik eratorritako exosomek gene anti-onkogenikoek behera egiten dutela baieztatu genezake, tumorearen hazkuntzan duten papera mantenduz.
Toxoplasma RH-rekin infektatutako BV2-tik eratorritako exosomek U87 glioma-zeluletan tumoreen aurkako geneak ezabatzea eragiten dute Toxoplasma RH-rekin infektatutako BV2-tik eratorritako exosomek.(A) FoxO1, PTEN eta PDCD4 adierazpenaren denbora errealeko PCR T. gondii RH infektatutako BV2tik eratorritako exosometan PBS exosomekin alderatuta.Kontrol gisa β-aktina mRNA erabili zen.(B) FoxO1 adierazpena Western blotting bidez zehaztu zen eta dentsitometriako datuak estatistikoki ebaluatu ziren ImageJ programa erabiliz. *P < 0,05 Student-en t testaren bidez lortu da. *P < 0,05 Student-en t testaren bidez lortu da. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 Student-en t-testa erabiliz lortu da. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Student-en t-testa erabiliz lortutakoa.
MiP-21 exosometan tumoreari lotutako geneen erregulazioan duen eragina ulertzeko, U87 zelulak miP-21 inhibitzaile batekin transfektatu ziren Lipofectamine 2000 erabiliz eta zelulak transfekzioa egin eta 24 ordura bildu ziren.FoxO1 eta p27 espresio-mailak miR-21 inhibitzaileekin transfektatutako zeluletan BV2-tik eratorritako exosomekin tratatutako zelulekin alderatu ziren qRT-PCR erabiliz (6A, B irudiak).MiR-21 inhibitzailea U87 zeluletara transfekzioak FoxO1 eta p27 adierazpena nabarmen jaitsi zuen (6. IRUDIA).
RH-k infektatutako BV2 exosomal eratorritako miP-21ek FoxO1/p27 adierazpena aldatu zuen U87 glioma zeluletan.U87 zelulak miP-21 inhibitzailearekin transfektatu ziren Lipofectamine 2000 erabiliz eta zelulak transfekziotik 24 ordura bildu ziren.FoxO1 eta p27 espresio-mailak miR-21 inhibitzaileekin transfektatutako zeluletan BV2-tik eratorritako exosomekin tratatutako zelulen mailak alderatu ziren qRT-PCR erabiliz (A, B).
Ostalariaren erantzun immuneari ihes egiteko, Toxoplasma parasitoa ehun-kiste bihurtzen da.Hainbat ehun parasitatzen dituzte, garuna, bihotza eta hezur-muskulua barne, ostalariaren bizitza osoan zehar eta ostalariaren erantzun immunologikoa modulatzen dute.Horrez gain, zelula ostalarien ziklo zelularra eta apoptosia erregula ditzakete, haien ugalketa sustatuz14,24.Toxoplasma gondii-k ostalarien zelula dendritikoak, neutrofiloak eta monozito/makrofago leinuak infektatzen ditu batez ere, garuneko mikroglia barne.Toxoplasma gondii-k M2 fenotipoko makrofagoen bereizketa eragiten du, patogenoen infekzioaren ondoren zaurien sendatzea eragiten du, eta hiperbaskularizazioarekin eta fibrosi granulomatosoarekin ere lotzen da.Toxoplasma infekzioaren jokabide-patogenia hau tumorearen garapenarekin lotutako markatzaileekin lotuta egon daiteke.Toxoplasmak araututako ingurune etsaiak dagokion minbizi aurrekoaren antza izan dezake.Hori dela eta, pentsa daiteke Toxoplasma infekzioak garuneko tumoreen garapenean lagundu behar duela.Izan ere, Toxoplasma infekzio-tasa altuak izan dira garuneko tumore desberdinak dituzten pazienteen serumean.Gainera, Toxoplasma gondii beste efektore kartzinogeno bat izan daiteke eta sinergikoki jarduten dute beste kartzinogeno infekzioso batzuek garuneko tumoreak garatzen laguntzeko.Ildo horretatik, nabarmentzekoa da P. falciparum eta Epstein-Barr birusak sinergikoki laguntzen dutela Burkitten linfomaren sorreran.
Exosomek minbiziaren ikerketaren arloan erregulatzaile gisa duten eginkizuna sakon ikertu da.Hala ere, parasitoen eta infektatutako ostalarien arteko exosomen papera ez da oso ondo ulertzen.Orain arte, hainbat erregulatzailek, jariatutako proteinak barne, protozoo parasitoek ostalariaren erasoari aurre egiteko eta infekzioa iraunarazteko prozesu biologikoak azaldu dituzte.Duela gutxi, protozooei lotutako mikrobesikulek eta haien mikroRNA-ek ostalari-zelulekin elkarreragiten duen kontzeptua gero eta handiagoa da, bizirauteko ingurune egokia sortzeko.Hori dela eta, azterketa gehiago behar dira miRNA exosomal alteratuen eta glioma zelulen ugalketaren arteko erlazioa ezagutzeko.MikroRNA alterazioa (kluster geneak miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 eta miR-17-92) STAT3 sustatzailearekin lotzen da toxoplasmaz infektatutako giza makrofagoetan, erregulatzen da eta anti-eragileak eragiten ditu. -apoptosia Toxoplasma gondii infekzioari erantzunez 29 .Toxoplasmaren infekzioak miR-17-5p eta miR-106b-5p-en adierazpena areagotzen du, hainbat gaixotasun hiperproliferatiborekin lotuta daudenak 30 .Datu hauek iradokitzen dute Toxoplasmaren infekzioak erregulatutako ostalari miRNAak parasitoen biziraupenerako eta ostalariaren portaera biologikoan patogeniarako molekula garrantzitsuak direla.
Aldatutako miRNAk zelula gaiztoen hastapenean eta progresioan hainbat jokabide-mota eragin ditzakete, gliomak barne: hazkuntza-seinaleen autosufizientzia, hazkuntza-seinaleekiko sentikortasun eza, apoptosiaren ihesa, potentzial erreplikatzaile mugagabea, angiogenesia, inbasioa eta metastasia eta hantura.Gliometan, miRNA alteratuak identifikatu dira hainbat espresio-profila azterketetan.
Ikerketa honetan, miRNA-21 adierazpen maila altua baieztatu dugu toxoplasmaz infektatutako ostalari-zeluletan.miR-21 tumore solidoetan, gliomak barne, gehiegi adierazten diren mikroARNetako bat bezala identifikatu da, 33 eta bere adierazpena gliomaren graduarekin erlazionatzen da.Ebidentzia pilatzeak iradokitzen du miR-21 gliomaren hazkuntzan apoptotikoen aurkako faktore gisa jarduten duen onkogeno berri bat dela eta giza garuneko gaixotasun gaiztoen ehunetan eta plasman oso gehiegi adierazten duena.Interesgarria da miR-21 inaktibitatea glioma zeluletan eta ehunetan zelulen ugalketa inhibitzea abiarazten du, caspasen menpeko apoptosiaren ondorioz.MiR-21 aurreikusitako helburuen analisi bioinformatikoak apoptosiaren bideekin lotutako tumore supresore-gene anitz agerian utzi zituen, besteak beste, programatutako zelula-heriotza 4 (PDCD4), tropomiosina (TPM1), PTEN eta forkhead box O1 (FoxO1), miR-2121 lotura gunearekin..22.38.
FoxO1, transkripzio-faktoreetako bat den heinean (FoxO), giza minbizi mota ezberdinen garapenean parte hartzen du eta tumore-zapatzaileen geneen adierazpena erregula dezake, hala nola p21, p27, Bim eta FasL40.FoxO1-ek zelulen zikloaren inhibitzaileak lotu eta aktibatu ditzake, hala nola p27, zelulen hazkuntza kentzeko.Gainera, FoxO1 PI3K/Akt seinaleztapenaren funtsezko efektore bat da eta prozesu biologiko asko erregulatzen ditu, hala nola, zelulen zikloaren progresioa eta zelulen bereizketa p2742 transkripzioaren aktibazio bidez.
Amaitzeko, uste dugu Toxoplasmak infektatutako mikrogliatik eratorritako miR-21 exosomalak paper garrantzitsua izan dezakeela glioma-zelulen hazkuntza-erregulatzaile gisa (7. irudia).Hala ere, ikerketa gehiago behar dira miR-21 exosomal, Toxoplasma infekzioaren eta gliomaren hazkundearen arteko lotura zuzena aurkitzeko.Emaitza hauek Toxoplasmaren infekzioaren eta gliomaren intzidentziaren arteko erlazioa aztertzeko abiapuntua izatea espero da.
Ikerketa honetan gliomaren (garunaren) kartzinogenesiaren mekanismoaren diagrama eskematiko bat proposatzen da.Egileak PowerPoint 2019-n marrazten du (Microsoft, Redmond, WA).
Ikerketa honetako protokolo esperimental guztiak, animalien erabilera barne, Seulgo National University Animal Care and User Committee Standard Etiko Jarraibideen araberakoak ziren eta Seulgo National University Medikuntza Eskolako Instituzio Berrikuspen Batzordeak onartu zituen (IRB zenbakia SNU-). 150715).-2).Prozedura esperimental guztiak ARRIVEren gomendioen arabera egin ziren.
BV2 saguaren mikroglia eta U87 giza glioma zelulak Dulbecco-ren Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seul, Korea) eta Roswell Park Memorial Institute-ren Medium (RPMI; Welgene)-n hazi ziren, hurrenez hurren, bakoitzak behi-serum fetalaren %10 zuen, 4 mM l-. glutamina, 0,2 mM penizilina eta 0,05 mM estreptomizina.Zelulak inkubagailu batean hazi ziren 37 °C-tan %5 CO2-arekin.Beste glioma zelula-lerro bat, U118, U87 zelulekin alderatzeko erabili zen.
T. gondii-k infektatutako RH eta ME49 anduietatik exosomak isolatzeko, 3-4 egun lehenago injektatutako 6 asteko BALB/c saguen sabeleko barrunbetik T. gondii takizoitoak (RH tentsioa) bildu ziren.Takizoitoak PBSrekin hiru aldiz garbitu eta %40 Percoll-en zentrifugazio bidez araztu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AEB)43.ME49 anduiaren takizoitoak lortzeko, BALB/c saguei intraperitonealki injektatu zitzaien 20 ehun-kistez eta kisteetan takizoitoen eraldaketa bildu zen sabeleko barrunbea garbituz infekzioaren ondorengo 6-8 egunean (PI).PBSz infektatutako saguak.ME49 takizoitoak 100 μg/ml penizilinarekin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, AEB), 100 μg/ml estreptomizina (Gibco/BRL) eta fetuko behi-serumarekin (Lonza, Walkersville, MD) % 5ean hazi ziren. .., AEB) 37 °C-tan eta %5 karbono dioxidoa.Vero zeluletan hazi ondoren, ME49 takizoitoak bi aldiz pasatu ziren 25 galgako orratz batetik eta, ondoren, 5 µm-ko iragazki batetik, hondakinak eta zelulak kentzeko.Garbitu ondoren, takizoitoak PBS44n berriro esekitzen ziren.Toxoplasma gondii ME49 anduiaren kisteak infektatutako C57BL/6 saguen garunetik isolatutako kisteen peritoneo barneko injekzioaren bidez mantendu ziren (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).ME49-k kutsatutako saguen garunak PI 3 hilabeteren ondoren bildu eta mikroskopioan xehatu ziren kisteak isolatzeko.Kutsatutako saguak patogenorik gabeko baldintza berezietan (SPF) mantendu ziren Seulgo Unibertsitate Nazionaleko Medikuntza Eskolan.
RNA osoa BV2-tik eratorritako exosometatik, BV2 zeluletatik eta ehunetatik atera zen miRNeasy Mini Kit-a erabiliz (Qiagen, Hilden, Alemania) fabrikatzailearen argibideen arabera, eluzio-urratsaren inkubazio-denbora barne.ARN kontzentrazioa NanoDrop 2000 espektrofotometro batean zehaztu zen.RNA mikromatrizeen kalitatea Agilent 2100 bioanalizatzaile baten bidez ebaluatu da (Agilent Technologies, Amstelveen, Herbehereak).
DMEM % 10eko exosoma pobrea duen FBSrekin ultrazentrifazio bidez 100.000 g-tan prestatu zen 16 orduz 4 °C-tan eta 0,22 µm-ko iragazki batetik iragazi zen (Nalgene, Rochester, NY, AEB).BV2 zelulak, 5 × 105, DMEMn hazi ziren, % 10eko exosomak agortutako FBS eta % 1 antibiotikoak 37 ° C-tan eta % 5 CO2 zeuzkan.24 orduko inkubazioaren ondoren, RH edo ME49 (MOI = 10) tentsioaren takizoitoak gehitu zitzaizkien zelulei eta inbaditzaile ez ziren parasitoak ordubeteko epean kendu eta DMEM-rekin berriro bete ziren.BV2 zeluletako exosomak zentrifugazio diferentzial aldatuaren bidez isolatu ziren, metodorik erabiliena.Jarri exosoma pelleta 300 µl PBStan RNA edo proteina aztertzeko.Isolatutako exosomen kontzentrazioa BCA proteina saiatze-kit baten bidez (Pierce, Rockford, IL, AEB) eta NanoDrop 2000 espektrofotometro baten bidez zehaztu zen.
BV2 zeluletako prezipitatuak edo BV2tik eratorritako exosomak PRO-PREP™ proteina erauzteko soluzioan lisatu ziren (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) eta proteinak %10eko SDS poliakrilamida geletan kargatu ziren Coomassie urdin distiratsu tindatutako geletan.Gainera, proteinak PVDF mintzetara transferitu ziren 2 orduz.Western blots balioztatu ziren Alix antigorputzak (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, AEB) markatzaile exosomiko gisa erabiliz.HRP-rekin konjugatutako ahuntz-saguaren aurkako IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, AEB) eta LAS-1000 plus irudi-analisi luminiszentea (Fuji Photographic Film, Tokio, Japonia) bigarren antigorputz gisa erabili ziren..Transmisiozko mikroskopia elektronikoa egin zen exosomen tamaina eta morfologia aztertzeko.BV2 zeluletatik isolatutako exosomak (6,40 µg/µl) karbonoz estalitako sareetan prestatu ziren eta % 2ko uranilo azetatoarekin negatiboki tindatu ziren 1 minutuz.Prestatutako laginak 80 kV-ko tentsio azeleratzailean behatu dira JEOL 1200-EX II (Tokio, Japonia) ES1000W Erlangshen CCD kameraz hornituta (Gatan, Pleasanton, CA, AEB) erabiliz.
BV2tik eratorritako exosomak PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AEB) erabiliz tindatu ziren 15 minutuz giro-tenperaturan.U87 zelulak, 2 × 105, PKH26 markatutako exosomak (gorria) edo exosomarik ez zuten kontrol negatibo gisa, 37 °C-tan inkubatu ziren 24 orduz % 5eko CO2 inkubagailu batean.U87 zelulen nukleoak DAPIz tindatu ziren (urdinez), U87 zelulak % 4ko paraformaldehidoan finkatu ziren 15 minutuz 4 ° C-tan eta, ondoren, Leica TCS SP8 STED CW mikroskopio konfokaleko sistema batean aztertu ziren (Leica Microsystems, Mannheim, Alemania).behagarria.
cDNA siRNAtik sintetizatu zen Mir-X siRNA lehen katearen sintesia eta SYBR qRT-PCR kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japonia) erabiliz.Denbora errealeko PCR kuantitatiboa iQ5 denbora errealeko PCR detektatzeko sistemaren bidez (Bio-Rad, Hercules, CA, AEB) egin zen SYBR Premix-ekin nahastutako abiarazte eta txantiloiak erabiliz.DNA anplifikatu zen 40 desnaturalizazio-ziklotan 95°C-tan 15 s-tan eta 60°C-tan 60 s-tan anplifikatu.PCR erreakzio bakoitzaren datuak iQ™5 sistema optikoko softwarearen (Bio-Rad) datuak aztertzeko modulua erabiliz aztertu ziren.Hautatutako helburu-genen eta β-aktina/siRNAren (eta U6) gene-adierazpenaren aldaketa erlatiboak kurba estandarraren metodoaren bidez kalkulatu ziren.Erabilitako lehen-sekuentziak 1. taulan agertzen dira.
3 x 104 U87 glioma zelula 96 putzuko plaketan hazi ziren eta BV2tik (50 μg/mL) edo BV2tik eratorritako Toxoplasma-k infektatutako exosomekin (50 μg/mL) edo BV2tik (50 μg/mL) eratorritako exosomekin nahastu ziren kontrol gisa 12, 18 eta 36 orduetan. .Zelulen ugaltze-tasa Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonia) erabiliz zehaztu zen (S1-S3 irudi osagarriak) 46 .
5 asteko BALB/c sagu biluzi emeak Orient Bio-n (Seongnam-si, Hego Korea) erosi ziren eta banan-banan gorde zituzten kaiola antzuetan giro-tenperaturan (22±2°C) eta hezetasunean (45±15°C).% giro-tenperaturan (22±2°C) eta hezetasunean (%45±15).12 orduko argi-ziklo bat eta 12 orduko ilun-ziklo bat SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center) pean egin ziren.Saguak ausaz 5 saguko hiru taldetan banatu ziren eta talde guztiei larruazalpeko 400 ml PBS injektatu zitzaizkien 1 x 107 U87 glioma zelula eta hazkuntza-faktore murriztua duten BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, AEB).Tumorea injektatu eta sei egun geroago, BV2 zeluletatik eratorritako 200 mg exosoma (Toxoplasma infekzioarekin/gabe) tumore-gunean injektatu ziren.Tumorearen infekzioa igaro eta hogeita bi egunera, astean hiru aldiz kalibre batekin neurtu zen talde bakoitzeko saguen tumorearen tamaina, eta tumorearen bolumena kalkulatu zen: 0,5 × (zabalera) × 2 × luzera.
MiRCURYTM LNA miRNA array erabiliz, 7. belaunaldiko mmu eta rno array-ak (EXIQON, Vedbaek, Danimarka) 1119 sagu ongi karakterizatutako 3100 giza, sagu eta arratoi miRNA harrapatzeko zundaren artean analisia.Prozedura honetan zehar, 250 eta 1000 ng-ko RNA guztira kendu ziren 5′-fosfatotik txahal hesteetako fosfatasa alkalinoarekin tratatuz eta ondoren Hy3 koloratzaile fluoreszente berdearekin etiketatuz.Ondoren, etiketatutako laginak hibridazio mikroarray-diapositibak kargatuz hibridazio-ganberako kit bat (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AEB) eta hibridazio-diapositiba kit bat (Agilent Technologies) erabiliz hibridatu ziren.Hibridazioa 16 orduz egin zen 56 °C-tan, eta gero mikroarrayak fabrikatzailearen gomendioen arabera garbitu ziren.Ondoren, prozesatutako mikroarray-diapositibak eskaneatu ziren Agilent G2565CA mikromatriz eskaner-sistema baten bidez (Agilent Technologies).Eskaneatutako irudiak Agilent Feature Extraction softwarearen 10.7.3.1 bertsioa erabiliz inportatu ziren (Agilent Technologies) eta irudi bakoitzaren fluoreszentzia-intentsitatea kuantifikatu zen aldatutako Exiqon protokoloaren GAL fitxategia erabiliz.Gaur egungo ikerketarako mikroarray datuak GEO datu-basean gordeta daude GPL32397 sarbide-zenbakiarekin.
Toxoplasmarekin infektatutako RH edo ME49 anduietako mikrogliako miRNA exosomal helduen adierazpen-profilak aztertu dira sareko hainbat tresna erabiliz.Tumorearen garapenarekin lotutako miRNAk miRWalk2.0 erabiliz identifikatu ziren (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) eta 8.0 baino handiagoa den seinalearen intentsitate normalizatuarekin (log2) iragazi ziren.MiRNAen artean, modu ezberdinean adierazitako miRNAak 1,5 aldiz baino gehiago aldatzen zirela aurkitu zen T. gondii-rekin infektatutako RH edo ME49 anduiek aldatutako miRNAen iragazki-analisiaren bidez.
Zelulak sei putzuko plaketan (3 x 105 zelula/putzu) aletu ziren opti-MEM-en (Gibco, Carlsbad, CA, AEB) Lipofectamine 2000 erabiliz (Invitrogen, Carlsbad, CA, AEB).Transfektatutako zelulak 6 orduz hazi ziren eta, ondoren, euskarria ingurune oso fresko batera aldatu zen.Zelulak transfekzioaren ondoren 24 ordura bildu ziren.
Analisi estatistikoa, batez ere, Student-en t-testa erabiliz Excel softwarearekin (Microsoft, Washington, DC, AEB).Animalien analisi esperimentaletarako, bi norabideko ANOVA bat egin zen Prism 3.0 softwarea erabiliz (GraphPad Software, La Jolla, CA, AEB). P-balioak < 0,05 estatistikoki esanguratsutzat jo ziren. P-balioak < 0,05 estatistikoki esanguratsutzat jo ziren. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P balioak <0,05 estatistikoki esanguratsutzat jo ziren. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P balioak <0,05 estatistikoki esanguratsutzat jo ziren.
Ikerketa honetan erabilitako protokolo esperimental guztiak Seulgo Unibertsitate Nazionaleko Medikuntza Eskolako Institutional Review Board-ek onartu zituen (IRB zenbakia SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Minbiziaren intzidentzia eta hilkortasun globalaren estimazioa 2018an: GLOBOCAN iturriak eta metodoak.Interpretazioa.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Garuneko tumoreen arrisku-faktoreen eta haien esku-hartze terapeutikoen ikuspegia. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Garuneko tumoreen arrisku-faktoreen eta haien esku-hartze terapeutikoen ikuspegia.Rashid, S., Rehman, K. eta Akash, MS Garuneko tumoreen eta esku-hartze terapeutiko nagusien arrisku-faktoreen berrikuspena. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Garuneko tumoreen arrisku-faktoreen eta esku-hartze terapeutikoen ulermen sakona.Rashid, S., Rehman, K. eta Akash, MS Garuneko tumoreen eta esku-hartze terapeutiko nagusien arrisku-faktoreen berrikuspena.Zientzia biomedikoa.Farmazialaria.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacterial-viral interactions in human orodigestive and female genital tract cancers: epidemiologia eta laborategiko ebidentziaren laburpena. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacterial-viral interactions in human orodigestive and female genital tract cancers: epidemiologia eta laborategiko ebidentziaren laburpena.Kato I., Zhang J. eta Sun J. Bacterial-viral interactions in the human gastrointestinal tract and female genital tract: epidemiologiako eta laborategiko datuen laburpena. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-birusen elkarrekintza giza aho-barrunbearen digestioan eta emakumezkoen ugaltze-aparatuan: gaixotasun ezagunen zientziaren eta laborategiko ebidentziaren laburpena.Kato I., Zhang J. eta Sun J. Bacterial-viral interactions in human gastrointestinal cancer and female genital cancer: epidemiologiako eta laborategiko datuen laburpena.Minbizia 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Infekziotik minbizira: nola aldatzen duten DNA tumoreen birusek ostalari-zelulen karbono eta lipidoen metabolismoaren erdialdea. Magon, KL & Parish, JL Infekziotik minbizira: nola aldatzen duten DNA tumoreen birusek ostalari-zelulen karbono eta lipidoen metabolismoaren erdialdea.Mahon, KL eta Parish, JL Minbiziaren suteen infekzioa: nola aldatzen duten DNAn oinarritutako tumore birusek ostalari-zelulen erdiko karbono eta lipidoen metabolismoa. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质仂谢 Magon, KL & Parish, JL Infekziotik minbizira: nola aldatzen duten DNA tumoreen birusek ostalari-zelulen karbono eta lipidoen metabolismoaren erdialdea.Mahon, KL eta Parish, JL Minbiziaren infekzioa eragiten du: nola aldatzen duten DNA tumoreen birusek ostalari-zeluletan karbono eta lipidoen metabolismo zentrala.Biologia Irekia.210004 (2021) 11.
Correia da Costa, JM et al.Eskistosomen eta gibeleko flukes eta helmintoekin lotutako minbiziaren katekol estrogenoak.aurrean.barrutik beroa.5, 444 (2014).